ELECTROFORESIS
Es una técnica para
la separación de moléculas según la movilidad de estas en un
campo eléctrico. La separación
puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido,
electroforesis en papel o en acetato de celulosa, o bien a través de una
matriz porosa electroforesis en gel, o bien en disolución electroforesis libre. Dependiendo de la técnica que se use, la separación
obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.
La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN
recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y
separar los diferentes polipeptidos resultantes de las variaciones del
experimento del ADN recombinante. La variante de uso más común para el análisis
de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida.
Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los
dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con
sustancias como el SDS detergente que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular
de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico,
éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel una red
tridimensional de fibras cruzadas, por lo que las pequeñas se moverán mejor,
más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán
cerca del lugar de partida.
La electroforesis es un método de laboratorio en el
que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar
biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz
gelatinosa.
FUNDAMENTO DE ELECTROFORESIS
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo.
El movimiento de las moléculas esta gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido tambien.
Métodos Electroforesis Zonales
Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente. Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este método tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos Los más utilizados son:
Electroforesis En Gel De Poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman por
polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es
químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma
rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad
mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena
visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la
ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de
manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea
menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad
